糖蛋白是发芽分析广泛存在于植物、动物和微生物机体内必不可少的糙米生物大分子,一般由多肽链和低聚糖链共价结合而成。糖蛋糖链影响多肽链或蛋白质的白抗折叠形态和整体构象。糖链与多肽链或蛋白质连接的炎降特殊结构使糖蛋白有多种存在形式,从而具有多种生物活性。血糖性糖蛋白具有预防肿瘤,发芽分析抗氧化,糙米降胆固醇,糖蛋提高机体免疫力等作用。白抗糙米发芽过程的炎降实质是糙米活化。发芽使糙米内部的血糖性多种酶被激发并且释放,从结合状态转化为游离状态,发芽分析释放出更多的糙米营养物质。发芽后的糖蛋糙米不仅含原有的肌醇六磷酸盐、膳食纤维、多种抗氧化物质以及游离态微量元素和多种维生素,还含有新生成的营养物质如γ-氨基丁酸等。其中蕴含的营养成分和活性物质显著提高,食用和保健功能大幅度增加。有研究表明,糙米发芽后,其糖蛋白性能也有所改变,糖蛋白含量随着萌发时间的延长而增加,且抗氧化性与萌发时间呈正相关。目前国内外对GBRG的相关研究鲜有报道。
本试验采取超声辅助提取GBRG,用DEAECellulose52阴离子交换层析法、SephadexG-200凝胶层析法分离纯化,对纯化的GBRG进行抗炎和降血糖性能分析。为进一步探寻消除炎症,改善胰岛素抵抗的天然药物功能性食品提供基础数据。
供试粳稻为“龙粳”,用龚谷机去除稻子外壳得到糙米,按照文献将糙米发芽并制备发芽糙米粗糖蛋白样品,冻干保存备用。
DEAE-Cellulose52,日本Pharmacia集团;脂多糖,北京索莱宝有限公司;硫酸、磷酸、乙酸、氯化铁、碘化钾、苯酚、硫酸铜、邻二氮菲、铁氰化钾、盐酸羟胺、邻苯三酚、硫酸亚铁、吡啶、乙酸酐、盐酸(分析纯)等,南京生物化学试剂研究中心;α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷、阿卡波糖,上海和氏璧化工有限公司。
680型酶标仪,日本Bio-Rad集团;CKX41型倒置显微镜,日本Olympus公司;Bj5060UV型CO2培养箱,美国Heraeus研究中心;DL-CJ-IN型超净工作台,南京医疗仪器制造中心;T25细胞培养瓶、24孔细胞培养板、96孔细胞培养板,德国Corning公司。
分离纯化流程GBRG粗品→上DEAE-Cellulose52阴离子柱→蒸馏水洗柱→氯化钠洗柱→绘制梯度洗脱曲线→洗脱峰透析、除盐、浓缩、冻干→溶于蒸馏水→上SephadexG200琼脂糖凝胶柱→氯化钠洗柱→确定梯度洗脱曲线→洗脱峰透析、浓缩、冻干备用。
每一步获得的GBRG均使用考马斯亮蓝法、苯酚-硫酸法检测其多糖及蛋白质含量。GBRG经DEAE-Cellulose52阴离子交换层析和SephadexG200琼脂糖凝胶柱层析,得到3个糖蛋白组分峰,分别命名为WEG、SEG-1和SEG-2。采用高效液相色谱、红外光谱、圆二色性、1H-NMR谱等方法进行结构分析,证明3个GBRG组分峰具有显著的糖蛋白特征。
参照Xie等、Kim等的试验方法并加以调整,经100ng/mLLPS诱导RAW264.7细胞,建立细胞炎症模型。
选用96孔培养板,分为3组:空白、对照、样品,3孔/组。将处于对数生长期的RAW264.7细胞配成浓度1×105个/mL的细胞悬液,各孔添加100μL,进行培育,过夜待用。各组分GBRG溶于细胞培养液,终浓度为滤膜微孔过滤,混入100μL浓度不一的含GBRG的培养液,再把培养板放于37℃、CO2体积分数5%的培养箱中,连续孵育24h,混入200μL5mg/mLMTT溶液/孔,培育4h。使用1mL注射器收集各孔中的上清液,与100μLDM-SO混合,振动摇匀8min使结晶物全部溶解,570nm检测细胞相对活力。
细胞相对活性=(样品组-空白组)/(对照组空白组)×100%
将RAW264.7细胞接于96孔板(5×105个/mL),划分成4组,培育过夜,各组包括3个重复孔。正常组:未加入LPS;LPS组:LPS质量浓度是1μg/mL;WEG糖蛋白组(50,100,200μg/mL)+1μg/mLLPS;SEG-1糖蛋白组(50,100,200μg/mL)+1μg/mLLPS;SEG-2糖蛋白组(50,100,200μg/mL)+1μg/mLLPS。先向细胞中添加各浓度糖蛋白,1h后加入LPS孵化24h。
按照IL-1β、β-actin、COX-2、iNOS与TNF-α的基因序列,由生工生物工程(上海)股份有限公司设计并合成。具体内容如表1所示:
选择总RNA试剂盒用以提取RAW264.7细胞的总RNA,测定RNA浓度。
逆转录反应的试剂为50ng~5μg总RNA、1μL引物Oligo(dT)18(0.5μg/μL)、10μL2×ES反应液、1μLRT/RI逆转录酶、1μLgDNA。将RNA模板、引物和DEPC水混合,65℃孵育5min后,冰浴2min,加入引物Oligo(dT)18,用于逆转录试验。42℃孵育15min,最后85℃孵育,使RT/RI与gDNA酶进行逆转录反应。
对逆转录所得到的cDNA进行PCR。在PCR管中加入SYBRGreen染料5μL、上游引物0.3μL、下游引物0.3μL、待测cD-NA5μL、DEPC水2.4μL。低速离心30s,使管内溶液完全混合,然后用RealtimePCR仪进行PCR扩增。反应条件为:94℃,5min预变性;65℃、2min,94℃、2min,共30个循环。
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自有腔调喜迎二十大|花椒地里话丰年甲醇中三唑醇溶液标准物质:为化学分析提供可靠参考苹果上海浦东店玻璃塔揭幕,行业资讯北美玻璃协会加入零能源商业建筑联合会,行业资讯黄连化学成分及药理作用研究进展 (一)加强合规经营 上海约谈美团等12家电商平台高效液相色谱(HPLC)定量检测花椒麻味物质含量方法的建立(二)上海市消保委就专门店《更换条款》约谈“加拿大鹅”丙酮中百菌清溶液标准物质:满足农药残留分析高标准铟元素溶液标准物质:助力科研与工业分析的高准确度复配食品添加剂对莜麦蔓越莓面包品质的影响(一)黑附球菌YP1分泌物的广谱抗霉菌活性和化学成分多样性分析(二)网络消费领域8大侵权问题突出 中国消费者协会建议再次修改《消费者权益保护法》超声辅助蒸馏法提取野菊花挥发油的工艺研究“消费者质疑:苹果,你太霸道了”追踪|苹果为消费者更换新手机,但依旧“不解释”!玻璃产业改变公开 产业创新仍任重道远,市场研究为“七日无理由退货”设门槛 雅戈尔被判无条件退款北京市市场监管局圆满完成冬奥会特种设备安全保障工作“清朗•打击流量造假、黑公关、网络水军”专项行动启动mini peace太平鸟童装 焕新活力 时尚出行南非世界杯启用玻璃屋顶球场 隔音效果超凡,行业资讯胎儿头偏大多少才算畸形?正在备孕发烧了37.53•15在行动|考证在线培训,套路咋就那么多(下)承诺天花乱坠 交费容易退费难城堡剧院正在进行一个600万美元的玻璃更换项目,行业资讯不同洁净度葡萄的葡萄酒发酵效果研究(二)中国消费者协会发布春节消费提示:四大低价套路专坑消费者石花菜化学成分与药理作用研究进展(三)中消协举办“3•15国际消费者权益日”主题活动婴儿鼻子不通气怎么办,适用的婴儿鼻塞清理方法分享中国消费者协会点评快递领域不公平格式条款和现象麦冬的炮制研究进展(二)喜迎二十大|广西梧州:以安全系数提升群众幸福指数食品添加剂二氧化碳中氰化氢测定方法的问题探索露蕊乌头化学成分和药理活性的研究进展铁皮石斛多糖提取及抗氧化活性研究(二)转谷氨酰胺酶催化的糖基化修饰对黑豆蛋白抗氧化活性的影响(一)二硫化碳中乙苯溶液标准物质:确保分析结果一致性收到的奶粉盲盒货不对板 海普诺凯被质疑虚假宣传纯碱及PVC拉动效应 明年进一步显现,市场研究Windows 7带动商机 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